Mutacijų dažnis. Mutantų identifikavimas

https://www.whatisepigenetics.com/epigenetic-study-of-histone-modifications-and-dna-damage-could-lead-to-new-cancer-treatments/

Mutacijų dažnis – tikimybė, jog ląstelės dalijimosi metu genas mutuos. Dažnis dažniausiai išreiškiamas laipsnio rodikliu, kurio pagrindas 10. Kadangi mutacijos yra labai retos, laipsnio rodiklis būna neigiamas. Pavyzdžiui, vienu atveju iš 10 000 atvejų ląstelei dalinantis genas mutuoja, taigi mutacijos dažnis yra 1/10 000 arba 10-4. Spontaninės mutacijos DNR replikacijos metu įvyksta labai retai, maždaug kartą per 109 kopijuojamų bazių porų (mutacijos dažnis 10-9). Kadangi vidutinis genas turi apie 1000 bazių porų, spontaninės mutacijos dažnis yra maždaug vienas iš 106 replikuojamų genų.

Mutacijos chromosomoje įvyksta daugiau ar mažiau atsitiktinai. Retai atsirandančios atsitiktinės mutacijos yra būtinos rūšių prisitaikymui prie aplinkos – rūšies evoliucijai genetinė įvairovė, sukuriama atsitiktinai ir mažu dažniu, yra naudinga. Pavyzdžiui, reikšminio skaičiaus bakterijų populiacijoje (didesnėje nei 107 bakterijų ląstelių), keli nauji mutantai atsiras kiekvienoje ląstelių kartoje. Dauguma mutacijų yra arba žalingos ir bus panaikintos iš genų baseino, kai individualios ląstelės žus, arba neutralios. Tačiau, atsiradusios mutacijos gali būti ir naudingos. Pavyzdžiui, mutacija, kurios rezultatas yra atsparumas antibiotikui, populiacijai, kuri reguliariai susiduria su antibiotikais. Kai atsiranda tokia savybė, ląstelės, turinčios šią mutacija, labiau tikėtina, jog išgyvens, ir dauginsis tol, kol aplinka išliks tokia pati. Netrukus, dauguma populiacijos ląstelių turės šį geną – įvyko evoliucinis pakitimas, nors ir nedideliu mastu.

Mutagenas dažniausiai padidina spontaninių mutacijų dažnį. Įprastai mutacijų dažnis yra vienas iš 106 replikuojamų genų, o esant mutagenui dažnis padidėja maždaug 10 - 1000 kartų. Kitaip tariant, esant mutagenui, mutacijos dažnis pakinta nuo maždaug 10-6 iki 10-5 ar 10-3. Mutagenai naudojami eksperimentiniams tikslams, tam kad būtų padidintas mutuotų ląstelių skaičius, tiriant mikroorganizmo genetines savybes bei komerciniams tikslams.

Mutantų identifikavimas

Mutantai gali būti nustatomi atrenkant arba testuojant pakitusį fenotipą. Nesvarbu ar naudojamas mutagenas, ar ne, mutantinės ląstelės su specifine mutacija visada yra retos, palyginus su kitomis ląstelėmis populiacijoje. Pagrindinė problema yra tokio reto įvykio nustatymas.

Eksperimentai dažnai atliekami su bakterijomis, nes šios greitai dauginasi, tad didelis organizmų skaičius (daugiau nei 109 skystos terpės mililitre) nesunkiai gaunamas ir panaudojamas eksperimente. Be to, kadangi bakterijos dažniausiai turi po vieną kiekvieno geno kopiją, mutavusio geno padarinys nėra maskuojamas normalios geno kopijos, kaip daugumoje eukariotinių organizmų.  

Teigiamoje selekcijoje atrenkame mutavusias ląsteles (atskiriame nuo nemutavusių). Pavyzdžiui, tarkime, kad norime identifikuoti mutantines bakterijas, kurios yra atsparios penicilinui. Kai bakterijų ląstelės yra užsėjamos ant terpės, kurioje yra penicilino, mutantai bus identifikuoti tiesiogiai. Tos kelios ląstelės populiacijoje, kurios turi atsparumą (mutantai) augs ir suformuos kolonijas, o normalios, penicilinui jautrios ląstelės, tokioje terpėje neaugs.

Kitokio tipo genuose mutacijos gali būti identifikuojamos naudojant neigiamą selekciją. Šio proceso metu atrenkamos ląstelės, kurios neatlieka tam tikros funkcijos, naudojant lėkštelių kopijavimo (replica plating) metodą. Pavyzdžiui, mes norime lėkštelių kopijavimą panaudoti identifikuojant bakterijas, kurios prarado gebėjimą sintetinti aminorūgštį histidiną. Pradžioje, apie 100 bakterijų ląstelių yra inokuliuojamos lėkštelėje su agarizuota terpe. Šioje lėkštelėje, vadinamoje pagrindine lėkštele (master plate), yra terpė su histidinu, ant kurios ląstelės galės augti. Po 18-24 valandų inkubacijos, kiekviena ląstelė suformuos koloniją. Tada sterilios medžiagos, pavyzdžiui, latekso ar filtrinio popieriaus, padėklas yra prispaudžiamas prie pagrindinės lėkštelės ir dalis ląstelių nuo kiekvienos kolonijos prikibs prie padėklo. Toliau, padėklas yra prispaudžiamas prie kelių (ar daugiau) sterilių lėkštelių (lyg daromi štampai). Vienoje iš šių lėkštelių yra terpė, kurioje nėra histidino, o kitoje – terpė su histidinu. Šiose lėkštelėse nemutavusios, originalios ląstelės, gali augti ir formuoti kolinijas. Kiekviena kolonija, kuri gali augti pagrindinėje lėkštelėje, bet negali sintetinti histidino, neaugs lėkštelėje su terpe be histidino. Tada galima atskirti mutantines kolonijas pagrindinėje lėkštelėje. Be abejo, kadangi mutacijos yra labai retos (net ir esant mutagenui), taip reikia patikrinti daug lėkštelių, kad būtų galima identifikuoti specifinį mutantą.

Lėkštelių kopijavimas yra labai efektyvus būdas identifikuojant mutantus, kuriems reikia vieno ar daugiau naujų augimo faktorių. Bet kuris mutantinis mikroorganizmas, kuriam būdingi mitybos reikalavimai skirtingi, nei tėviniams individams, vadinamas auksotrofu. Paprastai tariant, auksotrofas yra mikroorganizmas, kuris negali augti, jei terpėje nėra tam tikros medžiagos, jis ją privalo gauti iš aplinkos, nors tėvinis individas šią medžiagą geba pasigaminti pats. Pavyzdžiui, auksotrofas gali neturėti fermento, reikalingo tam tikros aminorūgšties sintezei, ir mutantas neaugs terpėje be šios aminorūgšties.

Sekit ir dalinkitės. Iki kito susitikimo :)

Informacijos šaltiniai: 

• Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. “Microbiology. An Introduction”. 11th edition. p.228-230