Įdomioji biologija: bakterijų dažymas Gramo būdu

https://en.wikipedia.org/wiki/Gram_staining

„Įdomioji biologija“ vėl grįžta į laboratoriją. Šį kartą apie tai, kodėl bakterijos skirstomos į gramteigiamas ir gramneigiamas bei kaip jas atskirti žiūrint pro mikroskopą.

Gramo dažymas (dažymas Gramo būdu) – bakterijų atskyrimo į dvi grupes būdas. Atskiriamos dvi grupės – gramteigiamos ir gramneigiamos bakterijos (ląstelės). Metodas paremtas bakterinių ląstelių sienelių cheminiais ir fizikiniais skirtumais (todėl čia galite prisiminti bakterinių ląstelių sienelių sudėtį). Dažymas Gramo būdu beveik visada yra pirmasis žingsnis, leidžiantis preliminariai identifikuoti bakterijas.

Metodo pavadinimas kilo iš jo išradusios danų bakteriologo Hans Christian Gram (1853-1938) pavardės. Gram metodą išrado Berlyno ligoninės morge 1884 metais kartu su Carl Friedländer. Gram šį metodą kūrė ne tam, kad galėtų atskirti vieną bakterijų tipą nuo kito, o tam, kad bakterijos taptų geriau matomos nudažytose plaučių audinių dalyse.

https://www.studyblue.com/notes/note/n/lab-exam/deck/17104757

Norint atlikti bakterijų dažymą Gramo būdu, reikia pasiruošti fiksuotą preparatą. Objektinis stiklelis, ant kurio bus ruošiamas preparatas, gerai nuvalomas etanoliu, kad ant jo nebūtų jokių kitų mikroorganizmų. Tada ant jo dedamas lašas distiliuoto vandens ir jame paskirstoma ląstelių masė, paimta su inokuliavimo kilpele. Paimtas ląstelių kiekis turi būti ne per didelis, nes kitaip per mikroskopą matysis vientisa masė. Sumaišius bakterijų ląsteles su vandeniu, palaukiama, kol išgaruos vanduo. Stikliuko kaitinti negalima, nes kitaip lizuosis (suplyš) ląstelės. Tepinėliui išdžiūvus objektinio stiklelio apatinė pusė pakaitinama 3 kartus po kelias sekundes virš liepsnos – taip fiksuojamas preparatas. Šis fiksavimas reikalingas tam, kad dažymo metu mikroorganizmai nenusiplautų. Tuo pačiu, fiksacijos metu, nužudomi dažomi mikroorganizmai. 

 
Tada ant paruošto preparato užpilamas bazinis dažas – kristalvioletas ir palaikoma apie 1 min. laiko. Po to pridedama jodo tirpalo ir palaikoma taip pat 1 min. Jodas padidina sąveiką tarp ląstelės ir dažo – kuo dažas stipriau prisikabina, tuo ryškiau nusidažo mėginys. Toliau mėginys blukinamas 95% etanoliu arba izopropanoliu-acetonu apie 20 sekundžių. Po blukinimo preparatas pakartotinai dažomas safraninu apie 1-2 min. Ant nudažyto preparato uždedamas dengiamasis stiklelis, užlašinamas lašas imersinės alyvos ir mėginys stebimas naudojant imersinį objektyvą (objektyvas yra įmerkiamas į užpiltą imersinę alyvą).

http://www.medicinehack.com/2012/02/gram-staining-procedure-mechanism.html

Gramteigiamos ląstelės turi daug peptidoglikano, kuris yra dehidratuojamas alkoholiu. Dėl dehidratacijos ląstelės sienelėje esančios poros užsidaro ir neleidžia netirpiam kristalvioleto-jodo kompleksui „išeiti“ iš ląstelės. Kompleksas lieka ląstelės viduje, todėl pro mikroskopą gramteigiamas ląsteles matysime violetinės spalvos. Gramteigiamų bakterijų pavyzdžiai: Bacillus, Listeria, Stapylococcus, Steptococcus, Enterococcus ir Clostridium genčių bakterijos.

Gramneigiamose ląstelėse alkoholis lengvai prasiskverbia pro lipidais turtingą išorinę membraną, kurios neturi gramteigiamos ląstelės ir pašalina kristalvioleto-jodo kompleksą iš ląstelės. Po poveikiu alkoholiu gramneigiamos ląstelės tampa beveik nematomos, todėl naudojamas antrasis dažas – safraninas. Pro mikroskopą gramneigiamas ląsteles matysime raudonos spalvos. Gramneigiamų bakterijų pavyzdžiai: cianobakterijos, spirochetos, žaliosios sieros bakterijos ir dauguma Proteobacteria klasės bakterijos.

http://www.differencebtw.com/difference-between-gram-positive-and-gram-negative-bacteria/

Esant senai kultūrai, gramteigiamos ląstelės gali dažytis kaip gramneigiamos. Taip pat yra gramvariabilių bakterijų rūšių – kai kurios tos pačios kultūros ląstelės yra gramteigiamos, o kai kurios – gramneigiamos. Dėl šių priežasčių dažymas Gramo būdu ne visada duoda tikslius rezultatus. Gramvariabilių bakterijų pavyzdžiai: dauguma Mycobacterium genties bakterijų.

Šiam kartui tiek. Sekit ir dalinkitės :)

Iki kito susitikimo

chekas

Informacijos šaltiniai:

• John G. Holt, Noel R. Krieg, Peter H.A. Sneath, James T. Staley, Stanley T. Williams (1994). Bergey‘s Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). p. 11.
• Mikrobiologijos laboratorinių metu gauta medžiaga.