Įdomioji biologija. PGR

http://www.chemagen.com/pcr-products.html

„Įdomioji biologija“ vėl keliasi į mano laboratoriją ir šį kartą papasakosiu apie PGR. Šios reakcijos modifikacijų yra daug, priklausomai nuo to, ką norima dauginti ir ką norima daryti su produktu toliau, tad čia bus aprašyti tik tie principai, kurie galiojai didžiajai daliai atliekamų PGR. Įspėju iš anksto, tekstas laukia ilgokas :D

Norint nustatyti genų sekas, klonuoti žinomus genus, įvertinti genų raišką, reikia padauginti (amplifikuoti) nukleorūgštis (DNR ir RNR). Dažniau atliekama DNR amplifikacija, nes jos dauginimo metodai yra geriau išvystyti ir pati DNR yra chemiškai stabilesnė, nei RNR. Jei reikia atlikti RNR amplifikaciją, pirma padaroma DNR kopija ir tada ji yra amplifikuojama.

https://www.youtube.com/watch?v=uXdzuz5Q-hs

Amplifikacija gali būti atliekama:

• in situ - nukleorūgštys yra pagausinamos negyvose atitinkamai paruoštose ląstelėse arba audiniuose, tam tikroje ląstelės ar chromosomos vietoje.
• in vivo - DNR fragmentas perkeliamas į ląstelę. Kai ląstelės dauginasi, vykstant replikacijai, padauginama ir DNR.
• in vitro naudojami replikacijoje dalyvaujantys fermentai – DNR polimerazės, kurios sintetina DNR kopijas.

Amplifikacija in vitro yra patogiausia ir greičiausia. Yra sukurta daug skirtingų amplifikacijos in vitro metodų. Vieniems metodams reikalingas ciklinis temperatūros kaitaliojimas, kiti atliekami esant pastoviai temperatūrai. Pats efektyviausias ir dažniausiai naudojamas yra polimerazės grandininė reakcija (PGR). Šio metodo pagalba iš 1 DNR kopijos galima gauti iki 10¹² DNR kopijų. Už PGR išradimą, 1993 metais Kary B. Mullis buvo apdovanotas Nobelio premija.

PGR principas. Atliekama cikliškai kaitaliojant reakcijos mišinio temperatūrą. Kiekvienas ciklas susideda iš vienas po kito einančių etapų: denatūracijos, pradmenų prilydymo ir polimerizacijos. Po kiekvieno ciklo iš 1 DNR molekulės yra susintetinamos 2 kopijos. Po n ciklų teoriškai susidaro 2ⁿ molekulių.

Etapai:

• Denatūracija. DNR denatūruojama, kad būdama viengrandė, galėtų prisijungti pradmenis. Denatūracijai naudojama 94-95°C temperatūra. Pradinė denatūracija vykdoma 3-5minutes. Vėliau, kiekvieno ciklo metu užtenka 30-45s.

https://chimmeral.wordpress.com/2014/04/11/dna-divorce-lets-get-denatured/

• Pradmenų prilydymas. Šio etapo efektyvumas priklauso nuo pradmenų sekos teisingo parinkimo ir tinkamos prilydimo temperatūros parinkimo. Pradmenų prilydymas yra komplementarus (nukleotidas adeninas (A) jungiasi su kitos grandinės timinu (T), o guaninas (G) su citozinu (C)) jų prisijungimas prie taikinio DNR. PGR reakcijai vienam aplifikonui (dauginamam fragmentui) padauginti reikalinga pradmenų pora: tiesioginis (kimba prie DNR fragmento pradžios) ir grįžtamasis pradmenys (kimba prie fragmento galo, priešingoje DNR grandinėje). Šie pradmenys turi hibridizuotis (prisijungti) prie skirtingų DNR grandinių vienoje DNR molekulėje. Paprastai pradmenys prilydomi 55-60°C temperatūroje. Jei pradmenys nėra visiškai komplementarūs, jie hibridizuojasi žemesnėje temperatūroje ir gaunamas mažesnis PGR jautrumas ir specifiškumas.

• DNR polimerizacija. PGR naudojamos termofilinės DNR polimerazės, kurios išlieka aktyvios po cikliškų temperatūros kaitaliojimų ir kaitinimų 94-95°C temperatūroje. DNR polimerizacija atliekama 72°C temperatūroje, kuri yra optimali dažniausiai PGR naudojamoms DNR polimerazėms. DNR sintezės laikas priklauso nuo amplifikono ilgio ir naudojamos DNR polimerazės greičio. Taq polimerazės sintezės greitis apie 3000nt/min. Su šia polimeraze polimerizacija vykdoma 1min kiekvieniems amplifikono 1000 nukleotidų. Paskutinio ciklo metu naudojamas trigubai ilgesnis polimerizacijos laikas, kad būtų pilnai užbaigta paskutinio ciklo metu gautas didelis DNR kopijų skaičius, esant jau sumažejusiam nukleotidų kiekiui.

PGR naudojami komponentai.

Pasiruošimas PGR. Viršuje - mėgintuvėliai su matricine DNR, dešiniame šone iš viršaus: dNTP, buferis, vanduo, pradmenų pora. Arčiau šoninių mėgintuvėlių - DNR, kuri bus panaudota kaip teigiama kontrolė. Likęs mėgintuvėlis skirtas reakcijos mišiniui pasigaminti.

Termofilinės DNR polimerazės. Jos yra patogios naudoti, nes:

• Taq (termofilinė) polimerazė išlieka stabili denatūracijos metu, todėl PGR galima atlikti viename mėgintuvėlyje sudėjus visus reikiamus reagentus (prieš atrandant Taq polimerazę, kiekvienas PGR etapas buvo vykdomas skirtingame mėgintuvėlyje).
• Taq polimerazės panaudojimas padidino PGR specifiškumą, nes aukštesnėje temperatūroje pradmenys hibridizuojasi žymiai specifiškiau.
• Didesnė PGR išeiga, gaunama daugiau produkto.

http://vitocovalucci.com/2016/04/dna-polymerase.html

Pradmenys. Reikalavimai PGR pradmenims:

• Turi būti specifiški amplifikuojamai DNR sekai ir neturi hibridizuotis kitose DNR vietose. Kuo pradmuo ilgesnis, tuo didesnis pasiekiamas specifiškumas. Paprastai naudojami 18-25 nukleotidų ilgio.
• Pradmenys turi būti komplementarūs amplifikuojamai DNR.
• Pradmenų lydymosi temperatūra neturėtų skirtis daugiau nei 5°C
• Pradmenys neturi būti komplementarūs patys sau (tai yra, turi jungtis su dauginamu DNR fragmentu, o ne vienas su kitu)

Norint nustatyti pradmenų prilydymo temperatūrą, reikia žinoti lydymosi temperatūrą. DNR lydimosi temperatūra (T_m) – temperatūra, kuriai esant pusė DNR molekulių yra denatūruotos (viengrandės). Pradmenų atveju pusė visų DNR matricos – pradmens hibridų bus denatūruoti. Prilydymo temperatūra 3-5°C mažesnė už lydymosi temperatūrą.

http://www.gmotesting.com/Testing-Options/Genetic-analysis

Deoksiribonukleotidtrifosfatai (dNTP). Kiekviena DNR molekulė sudaryta iš 4 skirtingų nukleotidų „Lego kaladėlių“ – adenino, timino, guanino ir citozino.

dNTP yra pardavinėjami kaip tirpalai. Šiuose tirpaluose nukleotidai sumaišyti vienodais santykiais. Jeigu santykis nėra vienodas, tai mažėja DNR polimerazės tikslumas, nes santykinai dažniau bus įjungiami tie nukleotidai, kurių koncentracija didesnė.

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNTP_nucleotide_incorporation_reaction.svg

Dvivalenčių metalų jonai. Jie yra būtini DNR polimerazių veiklai. PGR buferių sudėtyje visada būna Mg²⁺.

DNR matrica. PGR pagalba gali būti amplifikuojamos pačios įvairiausios nukleorūgštys. DNR gali būti gryninama iš įvairiausių šaltinių: bakterijų, grybų, augalų, gyvūnų.

PGR geriausiai vyks tik naudojant gryną DNR, kurioje nebus pašalinių medžiagų, kurios slopina PGR. Labai svarbu, kad amplifikuojama DNR nebūtų užteršta pašaline DNR (tokiu atveju gali būti dauginama ir pašalinė DNR).

Nepriklausomai nuo genomo dydžio, PGR yra svarbus pradinis taikinio molekulių skaičius, kuris paprastai būna 10⁴-10⁵ molekulių. Jei naudojamas mažesnis DNR kiekis, yra didesnė nespecifinių produktų susidarymo tikimybė. Naudojant didesnius kiekius, didėja tikimybė, kad su DNR į PGR gali patekti pašalinių medžiagų – PGR slopiklių. Kai matricos pridedama per mažai, gali nesusidaryti PGR produkto (dauginamo fragmento), kai pridedama per daug – elektroforezėje stebima šliūžė.

http://www.forshang.org/009humanlifescience/humanlifesciencee.htm

Buferinė sistema. PGR priedai. Turi būti palaikomas tam tikras tirpalo pH. Tirpalo pH palaiko buferis Tris. 

PGR ruošimui naudojamas šviežias dejonizuotas vanduo (toks vanduo, kuriame yra tik vandens molekulės. Geriamasis vanduo yra įvairių druskų tirpalas, tad PGR atlikti jis netinkamas).

Pasiruošiami mėgintuvėliai, kuriose vyks PGR

PGR atlikimas. Visi komponentai yra saugomi -20°C temperatūroje. Prieš atliekant reakciją, visi komponentai yra atšildomi, išskyrus DNR polimerazę. Į reakciją ji dedama paskutinė ir reikia stengtis jos nešildyti. Reakcijos mišinį pradedame pildami vandenį ir buferį, baigiame dauginama DNR, pradmenimis ir galiausiai DNR polimeraze (net nežinau kodėl, bet labai malonu stebėti, kaip į reakcijos mišinį įpilama polimerazė – jos tirpalas yra tirštesnis ir tai galima puikiai matyti :D)

Paprastai PGR atliekamos 25-100µl tūryje.

Kad galėtumėte įsivaizduoti, kokio dydžio mėgintuvėliuose atliekamas PGR

Paruošti mėginiai sudedami į termociklerį ir paleidžiama programa. Pasibaigus programai, dalis reakcijos mišinio analizuojama elektroforezės pagalba. Jei PGR produktas analizuojamas vėliau, mėginiai saugomi šaldiklyje -20°C temperatūroje.

Norint gauti patikimus rezultatus, ruošiant PGR reikia atlikti šias kontrolines reakcijas:

• Neigiama kontrolė be amplifikuojamos DNR. Jis parodo ar komponentai nėra užteršti DNR, kurioje amplifikuojamas taikinys (jei agarozės gelio nuotraukoje šis ruoželis švies - bad news... Neigiamoje kontrolėje produktas turi nesusidaryti, nes nededama matricinė DNR).
• Teigiama kontrolė, kuri parodytų, kad PGR komponentai ir sąlygos yra geri (į reakcijos mišinį pilama DNR, nuo kurios rezultatai jau yra gauti anksčiau).

A - tiriamas mėginys

K+ teigiama kontrolė

K- neigiama kontrolė

M - markeris ("liniuotė", pagal kurią galima susižinoti, kokio ilgio fragmentai gauti)

Aš, pilstanti mėginius elektroforezei :D

Informacijos šaltiniai:

• "Fermentas" ruošto modulio Nr. 10 "PGR metodas ir jo taikymas" p. 4-8, 10, 13, 15-18

P.S. All foreign readers are now able to translate a blog with a button on the right side of the blog :)