Tiesioginis mikroorganizmų populiacijos augimo skaičiavimas

http://www.labm.com/products/plate-count-agar.asp
Mikroorganizmų populiacijų augimas gali būti skaičiuojamas keliais skirtingais būdais. Vienais metodais galima suskaičiuoti ląstelių skaičių, kitais metodais galima apskaičiuoti visą populiacijos masę, kuri dažnai yra tiesiogiai proporcinga ląstelių skaičiui. Įprastai populiacijos vienetai išreiškiami ląstelių skaičiumi mililitre skysčio arba grame kietos medžiagos. Kadangi bakterijų populiacijos yra labai didelės, dauguma skaičiavimo metodų paremti tiesioginiais arba netiesioginiais nedidelių mėginių skaičiavimais, o tada suskaičiuojamas visos populiacijos dydis. Tarkime, kad milijoninėje mililitro dalyje (10-6 ml) sugižusio pieno yra 70 bakterinių ląstelių. Taigi viename mililitre bus milijoną kartų daugiau ląstelių (70 mln.). Šiame ir kitame įraše aptarsime tiesioginį ląstelių skaičiaus populiacijoje skaičiavimo metodą.

Lėkštelių metodas.
Vienas iš dažniausiai naudojamų metodų, norint pamatuoti bakterines populiacijas, yra lėkštelių metodas. Svarbus šio metodo privalumas yra tas, kad juo suskaičiuojamos gyvybingos ląstelės. Metodo trūkumas yra laikas – tam, kad susiformuotų matomos kolonijos reikia 24 valandų ar daugiau. Tam tikrais atvejais tai sukelia problemų, pavyzdžiui, pieno kokybės kontrolei, kai tam tikro mėginio negalima laikyti tokį ilgą laiko tarpą.

Lėkštelių metodas paremtas tuo, kad kiekviena gaunama kolonija yra susiformavusi iš vienos bakterinės ląstelės. Tai ne visada yra tiesa, kadangi bakterijos dažnai auga susijungusios į grandinėles ar grupes. Taigi, kolonija dažnai susiformuoja ne iš vienos ląstelės, bet iš nedidelės grandinėlės ar grupės dalies. Tam, kad būtų atspindėta ši realybė, yra įvedamas terminas kolonijas formuojantis vienetas (KFV. CFU – colony-forming unit). Apskritai, lėkštelių metodas gali būti vadinamas tiesiog kolonijas formuojančių vienetų skaičiavimu.

Kai yra atliekamas šis metodas, yra svarbu, kad lėkštelėje užaugtų tam tikras skaičius kolonijų. Kai užauga per daug kolonijų, tai ląstelėms pradeda trūkti vietos ir ne visos gali suformuoti kolonijas. Atliekant skaičiavimus tai sukelia netikslumus. Dauguma mikrobiologų siekia, jog vienoje lėkštelėje užaugtų 30-300 kolonijų. Tam, kad būtų užtikrintas toks skaičius kolonijų, pradinis inokuliatas yra praskiedžiamas keletą kartų – atliekamas serijinis skiedimas.
 
Serijinis skiedimas. Tarkime, kad viename mililitre pieno yra 10 000 bakterijų. Jei užsėsime 1 ml šio mėginio, tai teoriškai Petri lėkštelėje turėtų susidaryti 10 000 kolonijų. Akivaizdu, kad tiek atskirų kolonijų lėkštelėje nesusiformuos.
Jei 1 ml šio mėginio bus sumaišytas su 9 ml sterilaus vandens, tai kiekviename mililitre šio mėginio bus 1000 bakterijų. Jei šio gauto mėginio 1 ml bus užsėtas ant Petri lėkštelės, tai vis tiek būtų per daug sudėtinga suskaičiuoti 1000 atskirų kolonijų. Taigi, dar vienas skiedimas turi būti atliktas. 1 ml, kuriame yra 1000 bakterinių ląstelių, yra sumaišomas su 9 ml vandens. Kiekvienas šio gauto mėginio mililitras turės tik 100 bakterinių ląstelių. Jei ant lėkštelės užsėsime 1 ml paskutinio skiedimo mėginio, tai lėkštelėje užaugs 100 kolonijų – skaičius, kurį galima suskaičiuoti.

http://www.labm.com/products/plate-count-agar.asp
Be abejo, mes nežinome kiek ląstelių yra pradiniame mėginyje, todėl ant lėkštelių yra užsėjami visų skiedimų mėginiai. Tada atrenkamas tas, kuriame yra adekvatus skaičius susidariusių kolonijų, jos suskaičiuojamas ir žinant, kuris tai yra skiedimas, galima apskaičiuoti, kiek bakterinių ląstelių buvo pradiniame mėginyje.



Taigi, šiame etape turime pasidarę mėginio skiedinius (suspensijas), bet juos reikia užsėti ant lėkštelių. Tam yra keli būdai.

Suspensijų užpylimas ir paskirstymas. Arba 1 ml, arba 0,1 ml praskiestos bakterijų suspensijos yra įpilama į Petri lėkštelę. Mitybinė terpė, kuri yra nesustingusi ir laikoma 50°C vandens vonelėje, yra užpilama ant mėginio. Tada mėginys su terpe yra sumaišomas, lėkštelę švelniai sukiojant. Kai agaras sustingta, lėkštelė yra inkubuojama reikiamoje temperatūroje. Tai užpylimo metodas. Taikant šį metodą, kolonijos užaugs tiek pačiame agare, tiek ant jo paviršiaus.

Tačiau šis metodas turi tam tikrų trūkumų, kadangi kai kurie mikroorganizmai yra jautrūs karščiui ir gali būti pažeisti ištirpusio karšto agaro, o tada negalės suformuoti kolonijų (gaunami netikslūs rezultatai). Taip pat, kai naudojamos tam tikros diferencinės terpės, skiriamoji kolonijos išvaizda ant terpės paviršiaus yra svarbus diagnostinis požymis. Kad būtų išvengtos šios problemos, dažnai naudojamas paskirstymo metodas. 0,1 ml mėginio yra užpilamas ant iš anksto paruošto agaro paviršiaus. Tada mėginys yra paskirstomas su sterilia, specialios formos stikline ar metaline lazdele (špateliumi). Naudojant šį metodą visos kolonijos užaugs terpės paviršiuje ir bus išvengta kontakto su karštu neištirpusiu agaru.

Šiam kartui tiek. Kitame įraše pratęsime tiesioginį augimo skaičiavimą.

Sekit ir dalinkitės. Nauji įrašai kiekvieną pirmadienį ir ketvirtadienį. Iki kito susitikimo :)

chekas

Informacijos šaltiniai:
  • Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. “Microbiology. An Introduction”. 11th edition. p. 171-172

Komentarų nėra:

Rašyti komentarą

Follow by Email