Įdomioji biologija. Elektroforezė

Praeitą kartą, pasakodama apie tai, ką darau laboratorijoje, baigiau išskirtos DNR saugojimu. Norint ją naudoti tolimesniems tyrimams, išėmus iš šaldytuvo ji cenrifuguojama, kad vėl nusėstų ant mėgintuvėlio dugno. Etanolis išpilamas ir mėgintuvėliai paliekami išdžiūti. Svarbu per daug neišdžiovinti. Mėgintuvėlius reikia saugoti kaip įmanoma labiau nuo galimų mėginio užkrato šaltinių, pvz., žmogaus. DNR ištirpiname druskos rūgštyje. Ją jau galime naudoti tolimesniems tyrimams.

 

Šiek tiek patobulinom purtyklę :D

Reikia pasitikrinti, ar DNR tikrai išsiskyrė ir ar išskirta DNR yra reikiamo dydžio. Tam yra taikomas metodas, vadinamas nukleorūgščių elektroforezė.

Elektroforezė yra metodas, kurį naudojant vyksta dviejų ar daugiau skirtingus krūvius turinčių molekulių ar dalelių atskyrimas laidžioje terpėje veikiant elektros srovės elektriniam laukiu. Šis atskyrimas vyksta dėl skirtingų dalelių ar molekulių judrumų. Molekulės, turinčios skirtingus ar skirtingo dydžio krūvius, judės skirtingomis kryptimis arba skirtingu greičiu link priešingą krūvį turinčių elektrodų.

DNR yra sudarytos iš heterociklinių azotinių bazių, ribozės ir fosfato, per kurį nukleozidai yra sujungti į polinukleotidinę grandinę. Fosfatas suteikia neigiamą krūvį, todėl elektriniame lauke, DNR molekulės juda link teigiamai įkrauto elektrodo. DNR neigiamas krūvis paskirstytas tolygiai ir bet kokio ilgio nukleorūgšties fragmentui krūvio/dydžio santykis yra vienodas. DNR elektroforezė vykdoma gelyje tam, kad fragmentai būtų „sijojami“ pagal dydį. Kuo trumpesnis fragmentas, tuo mažesnį pasipriešinimą sutinka gelyje, tuo jo judrumas didesnis, t.y., jis juda greičiau.

http://dnarnanews.blogspot.lt/2013/04/what-is-three-parts-of-nucleotide.html

Elektoforezei labai svarbūs yra buferiai. Tai yra tirpalas, kuris palaiko pastovią pH reikšmę ir tokiu būdu užtikrina biomolekulių pastovų krūvį. Tirpale esančios druskos taip pat užtikrina elektros laidumą (jonai perneša elektronus ir teka elektros srovė). Į tirpalų sudėtį įeina ir medžiagos (EDTA), kurios suriša metalų jonus, keičiančius elektroforezinį judrumą.

Atlikimas.

Pradžioje pasiruošiame gelį. Santykiu 1:9 prasiskiedžiame buferį, supilame 1g agarozės (angliavandenis). Palaikome, kad išbrinktų. Mišinį užviriname mikrobanginėje, gerai išmaišome ir leidžiame šiek tiek atvėsti (labai svarbu saugoti rankas išimant kolbą iš mikrobangės. Jau spėjau kartą gana stipriai nusideginti garais...). Paliekame šiek tiek atvėsti, o per tą laiką susidedame vonelę. Kai kolbą su ištirpinta agaroze galime paimti į ranką, įpilame į kolbą etidžio bromido (100ml agarozės tirpalo reikia 15μl etidžio bromido).

Etidžio bromidas yra fluorescuojantis dažas. Dirbant su etidžio bromidu būtina naudoti jam nepralaidžias pirštines, kadangi jis yra stiprus mutagenas, patekęs į organizmą gali sukelti mutacijas. Etidžio bromidas įsiterpia į tam tikras DNR vietas. Juo nudažytos DNR nustatymui reikalinga ultravioletinė šviesa.

Etidžio bromidas šviesoje skyla, todėl būtina jį laikyti taip, kad būtų apsaugotas nuo šviesos

Paruoštas gelis supilamas į vonelę, sudedamos šukutės, kurios padarys šulinėlinius mėginiams supilti ir gelis paliekamas sustingti.

Kol stingsta gelis, paruošiami mėginiai. Tiriamasis mėginys sumaišomas su užnešimo dažu. Šis dažas turi kelias sudedamąsias dalis:

• Glicerolis, kuris suteikia mėginiui klampumo, kad jis nuskęstų gelio šulinėlyje.
• Bromfenolis, ksilencianolis, kurie suteikia dažui spalvą, galima pamatyti kaip mėginys užnešamas ir ar jis yra užneštas. Suteikia galimybę įvertinti elektroforezės eigą. Kiekvienas dažas juda kaip tam tikro ilgio DNR fragmentas.
• EDTA. Suriša metalų jonus, kurie trikdo normalią DNR migraciją.
• SDS, karbamidas, kurie denatūruoja (suardo) baltymus, sąveikaujančius su DNR. DNR ir baltymo kompleksas judės lėčiau.

Su dažu sumaišytus mėginius supilame į šulinėlius. Į pirmąjį takelį įpilame markerio. Jį galima įsivaizduoti kaip liniuotę. Markeryje yra tam tikro, žinomo ilgio DNR fragmentai. Jis yra skirtas tam, kad galėtume lengvai pamatyti, kokio dydžio DNR fragmentus turime.

Supylus mėginius patikriname ar yra užtektinai buferio. Jo turi būti tiek, kad vos semtų gelį. Prijungiami elektrodai. Jau rašiau, kad DNR yra neigiama, todėl judės link teigiamo elektrodo. Labai svarbu elektrodų nesumaišyti vietomis, nes galima užsižiopsojus prarasti mėginius. Paleidžiama elektros srovė.

Laukiama, kol mėginys nueis reikiamą atstumą. Laikas priklauso nuo gelio koncentracijos, DNR fragmentų dydžio, parinktos elektros srovės, buferio savybių ir t.t.

Pasibaigus elektroforezei, gelis yra perkeliamas į UV šviesą ir daroma jo nuotrauka. Analizuojama turimo dydžio DNR fragmentai ir įvairios priemaišos.

Pirmasis takelis - markeris. Antrajame takelyje matoma išskirta DNR. Čia yra vienas pirmųjų mano DNR skyrimų, tad jis toli gražu netobulas. Ryškiausiai šviečia vabzdžio DNR molekulė. Kitos siauros linijos (2 takelyje) - "nespecifika". Kuo mažiau nespecifikos, tuo išskyrimas sėkmingesnis.

Iki kito susitikimo :)

chekas

Informacijos šaltiniai:

• "Fermentas" ruošto modulio Nr. 2 "Nukleorūgščių elektroforezė" p. 3,5,9,11

P.S. All foreign readers are now able to translate a blog with a button on the right side of the blog :)